¿Cómo se mide la actividad de ADAMTS13?

12 minutos

ADAMTS13
Diagnóstico/seguimiento

Diversas técnicas pueden evaluar la actividad de ADAMTS13 e identificar anticuerpos inhibidores. Normalmente, la evaluación de la actividad de ADAMTS13 tiene más valor clínico que las pruebas centradas únicamente en la cantidad de ADAMTS13, conocido como antígeno ADAMTS13.1

Ensayos de actividad

 

Para confirmar el diagnóstico de PTT2 (Púrpura Trombótica Trombocitopénica) es necesario una prueba que mida la actividad de ADAMTS13. Por ello, la medición de la actividad de ADAMTS13 se ha vuelto cada vez más importante en la evaluación y tratamiento de pacientes con PTT.3

 

Los primeros ensayos de ADAMTS13, que utilizaban multímeros de FVW derivados del plasma como sustrato, implicaban pasos laboriosos de despliegue conformacional que consumían mucho tiempo. Sin embargo, los principios de las pruebas han avanzado significativamente. Hoy en día, la mayoría de los ensayos utilizados para medir la actividad de ADAMTS13 se basan en tecnologías de ensayos de inmunoabsorción ligados a enzimas (ELISA) o de transferencia de energía por resonancia fluorescente (FRET), que emplean fragmentos recombinantes de FVW que incluyen el sitio de corte de ADAMTS13 [Tirosina 1605-Metionina 1606].4

 

Los ensayos de actividad de ADAMTS13 incluyen dos pasos clave5:

 

  1. el plasma de ensayo se incuba con el sustrato (multímeros de FVW de longitud completa o péptidos truncados que contienen el sitio de escisión ADAMTS13), lo que da lugar a la proteólisis del sustrato por ADAMTS13 presente en el plasma de ensayo

     

  2. El producto de escisión se detecta y cuantifica ya que es proporcional al nivel de actividad ADAMTS13 en el plasma de ensayo.

 

Los métodos de detección pueden ser directos (midiendo el producto de corte) o indirectos (midiendo el FVW residual).5

 

El límite de detección inferior de los ensayos actuales de actividad de ADAMTS13 es de menos del 1% al 5%.5

test
Cómo se mide la actividad de ADAMTS13_img1_tablet
Cómo se mide la actividad de ADAMTS13_img1_mobile
Cómo se mide la actividad de ADAMTS13_img2_desktop
Cómo se mide la actividad de ADAMTS13_img2_tablet
Cómo se mide la actividad de ADAMTS13_img2_mobile

El ensayo FRET-FVW73 detecta el aumento de fluorescencia generado por un fragmento sintético modificado de 73 aminoácidos del dominio A2 del FVW (FRET-FVW73) cuando es escindido por ADAMTS13 en el plasma.4 TEl grado de fluorescencia es directamente proporcional a la actividad de ADAMTS13.4

Una limitación de este ensayo es que la hiperbilirrubinemia severa interfiere con los ensayos basados en FRET. Para solucionar esto, el plasma de prueba puede diluirse para reducir la concentración de bilirrubina, aunque esto puede ocasionar una posible pérdida de sensibilidad en la detección.5

El ensayo cromogénico de actividad ADAMTS13 mediante inmunoensayo ligado a enzimas (ELISA) utiliza el anticuerpo monoclonal N10 que detecta directamente el sitio de escisión de un péptido sintético de 73 aminoácidos, FVW738

Los kits de ensayo incluyen calibradores para crear una curva de calibración, a partir de los cuales se puede establecer la actividad ADAMTS13 en las muestras de prueba.4

Es importante evitar el uso de plasma tratado con EDTA en este ensayo, ya que el EDTA retira cationes divalentes del dominio metaloproteinasa de ADAMTS13, dejándolo inactivo.9

En este ensayo, el FVW purificado se incuba con plasma durante 24 horas. La escisión del FVW por ADAMTS13 presente en el plasma se produce, reduciendo el tamaño de los multímeros de FVW. Esta reducción se visualiza mediante electroforesis en gel de agarosa seguida de un Western blot con un anticuerpo anti-FVW conjugado con peroxidasa. La concentración de actividad de ADAMTS13 en la muestra de prueba se establece en referencia a una serie de muestras de plasma normal diluidas.4

El plasma normal o el FVW purificado se incuban con la muestra de plasma de prueba en presencia de BaCl2 y 1.5M de urea, lo que expone el sitio de escisión de ADAMTS13. El FVW es escindido por ADAMTS13 presente en la muestra de plasma de prueba, y el FVW residual se mide con un ensayo ELISA mediante su unión al colágeno Tipo III.4

Este ensayo es similar al de unión al colágeno mencionado, excepto que el FVW residual se mide por agregación plaquetaria inducida por ristocetina usando un agregador de plaquetas.4

Limitaciones de los ensayos:

 

  • La realización de pruebas oportunas ayudan al rápido diagnóstico o exclusión de la PTT, mejorando el manejo de los pacientes, reduciendo los riesgos y costos de intercambios de plasma innecesarios.1 Sin embargo, los métodos actuales no están completamente automatizados y se limitan a los laboratorios especializados, lo que provoca un retraso de 4 a 6 días en algunas áreas para la disponibilidad de los resultados de actividad de ADAMTS13.10 Las guías recientes de ISTH sobre PTT indican que resultados disponibles en menos de 72 horas son ideales, mientras que aquellos entre 72 horas y 7 días son aceptables.11
  • Niveles elevados de FVW endógeno, hemoglobina libre, hiperlipidemia y proteasas plasmáticas también pueden inhibir ADAMTS13 in vitro, causando un nivel de actividad falsamente bajo en la mayoría de los ensayos.5
  • Para garantizar la precisión en los resultados, es ideal que las muestras de diagnóstico destinadas a la medición de la actividad de ADAMTS13, así como las pruebas de anticuerpos, se tomen antes de iniciar el tratamiento. Sin embargo, incluso las muestras obtenidas hasta 72 horas después de realizar intercambios plasmáticos diarios conservan su relevancia diagnóstica en el contexto de la Púrpura Trombótica Trombocitopénica (PTT). De hecho, aproximadamente el 80% de los pacientes diagnosticados con PTT presentan actividades de ADAMTS13 inferiores al 10% cuando se evalúan después de tres procedimientos consecutivos de intercambio de plasma.5
  • En la actualidad, no existe un estándar internacional, ni material de control de calidad, ni unidades oficialmente reconocidas para ADAMTS13.4
  • Diversos estudios han comparado e identificado discrepancias entre diferentes tipos de ensayos. Por lo tanto, en caso de resultados discrepantes con la presentación clínica, puede ser necesario realizar un segundo ensayo empleando una metodología alternativa.5

Ensayos de anticuerpos anti-ADAMTS13

 

  • Se utilizan para diferenciar iPTT de cPTT, utilizando la detección de anticuerpos anti-ADAMTS13 mediante técnicas de ELISA o el ensayo de Bethesda.9
  • La detección persistente de anticuerpos durante periodos de remisión clínica, pueden indicar un mayor riesgo de recaída de PTT. Los niveles altos de anticuerpos se correlacionan con resistencia al tratamiento y aumento de mortalidad.12
  • Los anticuerpos ADAMTS13 pueden: neutralizar la actividad proteolítica (2/3 de los casos) o aumentar el aclaramiento (1/3 de los casos), y muchos pacientes tienen ambos.12
  • Los anticuerpos neutralizantes se detectan y cuantifican mediante el ensayo de inhibidor funcional ADAMTS13, que se realiza cuando el nivel de actividad del ADAMTS13 está por debajo del nivel de corte predefinido (10%-30%).5
Cómo se mide la actividad de ADAMTS13_img3_desktop
Cómo se mide la actividad de ADAMTS13_img3_tablet
Cómo se mide la actividad de ADAMTS13_img3_mobile
Cómo se mide la actividad de ADAMTS13_img4_desktop
Cómo se mide la actividad de ADAMTS13_img4_tablet
Cómo se mide la actividad de ADAMTS13_img4_mobile

Los ensayos de Bethesda se utilizan para detectar y cuantificar autoanticuerpos neutralizantes. El plasma del ensayo se trata térmicamente para inactivar cualquier molécula de ADAMTS13 aún presente, dejando intactos los autoanticuerpos en el plasma. A un volumen de este plasma tratado se le añade un volumen de plasma combinado normal (NPP), la fuente de ADAMTS13 en el ensayo. Se prepara una mezcla de control separada con iguales volúmenes de NPP y un buffer; de esta forma ambas muestras inician el ensayo con el mismo nivel de ADAMTS13. A continuación, ambas muestras se incuban durante 30 a 120 min, dependiendo del protocolo, para permitir la formación de complejos antígeno-anticuerpo. Luego, se mide la actividad ADAMTS13 de cada muestra (ensayo y control) en un ensayo funcional, y la actividad residual de ADAMTS13 de la muestra de ensayo se calcula como un porcentaje del de la muestra de control sometida a condiciones de incubación idénticas. Una unidad Bethesda (BU) es un título inhibidor que disminuye la actividad residual al 50% del valor esperado. La realización de una serie de diluciones permite la determinación del título.2

En lugar de interferir con la actividad proteolítica de ADAMTS13, los anticuerpos no neutralizantes promueven la eliminación ADAMTS13 del plasma. Estos anticuerpos IgG no presentan inhibición funcional en los ensayos y pueden medirse mediante ELISA o Western blot.5

Las pruebas de detección de anticuerpos ADAMTS13 son más fáciles y menos costosos que un ensayo de Bethesda y utilizan la técnica de ELISA para detectar los anticuerpos del paciente en una placa recubierta de ADAMTS13. Mediante ELISA se identificarán todos los anticuerpos, independientemente de sus propiedades neutralizantes o no neutralizantes12. Es una técnica altamente sensible; se identifican anticuerpos en el 97% de los pacientes con iPTT, que carece de especificidad, ya que también se detectan anticuerpos en el 4% de los individuos sanos y en el 13% de los pacientes con lupus eritematoso sistémico.5

Limitantes de los ensayos:

 

  • La detección de inhibidores de ADAMTS13 mediante la técnica Bethesda-like, también muestra variabilidad, dependiendo de la técnica analítica utilizada.2
  • Una limitante significativa del ensayo ELISA es la posibilidad de detectar anticuerpos no ADAMTS 13, que pueden estar presentes en pacientes con enfermedades autoinmunes, especialmente si hay altos niveles de dichos anticuerpos presentes. 2
  • En casos de resultados negativos, el ensayo debe repetirse en diferentes momentos, ya que durante el ataque agudo de PTT, los pacientes a veces no presentan autoanticuerpos, probablemente debido a la formación de inmunocomplejos con ADAMTS13 y autoanticuerpos circulantes.8
  • Medir la actividad de ADAMTS13 en los progenitores de pacientes afectados para confirmar una depleción leve a moderada de ADAMTS13, generalmente vista en individuos con mutaciones heterocigotas de ADAMTS13, es útil para el diagnóstico de PTT congénita.8

Compartir este artículo con un colega

Este sitio web está destinado a una audiencia internacional de profesionales de la salud fuera de los EE. UU. y el Reino Unido. No debe compartirse con pacientes, cuidadores o público en general.

Abreviaturas, glosario y referencias

Abreviaturas

ADAMTS13; Una desintegrina y metaloproteinasa con motivos de trombospondina 13

Cr; Nivel de creatinina

cPTT; PTT congénita

ELISA; Ensayo de inmunoabsorción enzimática

TRASTE; Transferencia de energía por resonancia fluorescente

FRETS-FVW73; Ensayo de traste con un péptido de 73 aminoácidos de FVW

IgG; Inmunoglobulina G

iPTT; PTT inmunomediada

PLT; Plaqueta

rFVW; FVW recombinante

SDS; Dodecil sulfato de sodio

SDS-PÁGINA; Electroforesis en gel de poliacrilamida SDS

MAT; Microangiopatía trombótica

PTT; Púrpura trombocitopénica trombótica

FVW; Factor Von Willebrand

 

Glosario

ADAMTS13; ADAMTS13 (Disintegrina y metaloproteasa con motivos Trombospondina 13) e es una enzima constitutivamente activa (metaloproteasa plasmática) que cataliza la descomposición del factor de von Willebrand (FVW) de ultra grande y alto peso molecular en multímeros más pequeños, reduciendo su potencial trombogénico y manteniendo la hemostasia13,14

Incidencia; La tasa de nuevos casos o eventos durante un período específico para la población en riesgo de un determinado evento.

anemia hemolítica microangiopática (AHMA); Proceso de destrucción de glóbulos rojos dentro de la microvasculatura acompañado de trombocitopenia debido a la activación y consumo de plaquetas. La púrpura trombocitopénica trombótica (PTT) y el síndrome urémico hemolítico (SUH) son formas primarias de microangiopatías trombóticas15

Prevalencia; La proporción de una población en particular que se encuentra afectada por una afección médica en un momento específico.

Esquistocito; Fragmentos circulantes de glóbulos rojos que se observan comúnmente en frotis de sangre de pacientes con microangiopatías trombóticas, incluida la PTT16

Trombocitopenia; Se refiere a una disminución del recuento plaquetario por debajo de los niveles normales (150x109/L) y puede ser causada por una amplia variedad de etiologías que disminuyen la producción o aumentan el consumo de plaquetas17

Microangiopatía trombótica (MAT); La MAT incluye un conjunto diverso de síndromes que pueden ser hereditarios o adquiridos, que pueden ocurrir en niños y adultos con un inicio repentino o gradual.

Los síndromes de MAT, a pesar de ser diversos, tienen un conjunto común de características clínicas y patológicas: AHMA, trombocitopenia, lesión orgánica, daño vascular manifestado por trombosis arteriolar y capilar con anomalías características en el endotelio y la pared del vaso18

Púrpura trombocitopénica trombótica (PTT); La PTT es un tipo de AHMA que se presenta con trombocitopenia moderada o grave. Hay disfunción orgánica asociada, incluyendo afectación neurológica, cardíaca, gastrointestinal y renal; La oliguria o insuficiencia renal anúrica que requiere terapia de reemplazo renal no suele ser una característica. La PTT se confirma por una deficiencia grave (<10%) de la actividad ADAMTS13 .19

factor von Willebrand (FVW)El FVW desempeña dos funciones clave en la hemostasia: 1) en la hemostasia primaria (mediada por plaquetas), el FVW se une al colágeno y las plaquetas, promoviendo así la activación y agregación plaquetaria, y 2) en la hemostasia secundaria (mediada por factores de coagulación), el FVW se une al factor VIII (FVIII) protegiéndolo de un aclaramiento rápido. Cuando el FVW se une al colágeno después de una lesión vascular, libera FVIII, lo que conduce a la activación del FVIII y al inicio de la cascada de coagulación.20,21

 

Referencias

  1. Favaloro, E.J., et al., Pruebas de laboratorio para ADAMTS13: utilidad para el diagnóstico/exclusión de PTT y más allá. Am J Hematol, 2021. 96(8): págs. 1049-1055.
  2. Dainese, C., et al., Anti-ADAMTS13 Autoanticuerpos: De la fisiopatología al impacto pronóstico: una revisión para clínicos. J Clin Med, 2023. 12(17).
  3. Masias, C. y S.R. Cataland, El papel de las pruebas de ADAMTS13 en el diagnóstico y tratamiento de las microangiopatías y trombosis trombóticas. Sangre, 2018. 132(9): págs. 903-910.
  4. Practical-Haemostasis.com. ADAMTS13 ensayos. [Consultado el 26/06/2024]; Disponible en: https://practical-haemostasis.com/Miscellaneous/adamts13_assays.html.
  5. Chiasakul, T. y A. Cuker, Diagnóstico clínico y de laboratorio de PTT: un enfoque integrado. Hematology Am Soc Hematol Educ Program, 2018. 2018(1): pág. 530-538.
  6. Sukumar, S., B. Lammle y S.R. Cataland, Púrpura trombocitopénica trombótica: fisiopatología, diagnóstico y tratamiento. J Clin Med, 2021. 10(3): pág. 536.
  7. Coppo, P., et al., Características predictivas de la deficiencia grave de ADAMTS13 adquirida en microangiopatías trombóticas idiopáticas: la experiencia del centro de referencia francés MAT. PLoS One, 2010. 5(4): pág. e10208.
  8. Sakai, K. y M. Matsumoto, Manifestaciones clínicas, terapia actual y futura y resultados a largo plazo en la púrpura trombocitopénica trombótica congénita. J Clin Med, 2023. 12(10): pág. 3365.
  9. Bonnez, Q., K. Sakai y K. Vanhoorelbeke, ADAMTS13 y biomarcadores no ADAMTS13 en la púrpura trombocitopénica trombótica inmunomediada. J Clin Med, 2023. 12(19).
  10. Roose, E. y B.S. Joly, Perspectivas actuales y futuras sobre ADAMTS13 y la púrpura trombocitopénica trombótica. Hamostaseologie, 2020. 40(3): págs. 322-336.
  11. Zheng, X.L., et al., Directrices de ISTH para el diagnóstico de la púrpura trombocitopénica trombótica. J Thromb Haemost, 2020. 18(10): págs. 2486-2495.
  12. Smock, K.J., ADAMTS13 actualización de las pruebas: enfoque en los aspectos de laboratorio de los diagnósticos difíciles de púrpura trombocitopénica trombótica y los efectos de las nuevas terapias. Int J Lab Hematol, 2021. 43 Supl. 1: pág. 103-108.
  13. Markham-Lee, Z., N.V. Morgan y J. Emsley, Mutaciones ADAMTS13 hereditarias asociadas con la púrpura trombocitopénica trombótica: una breve revisión y actualización. Platelets, 2023. 34(1): pág. 2138306.
  14. Kremer Hovinga, J.A., et al., Púrpura trombocitopénica trombótica. Nat Rev Dis Primers, 2017. 3: pág. 17020.
  15. Arnold, D.M., C.J. Patriquin e I. Nazy, Microangiopatías trombóticas: un enfoque general para el diagnóstico y el tratamiento. CMAJ, 2017. 189(4): págs. E153-E159.
  16. Zini, G., et al., Recomendaciones del ICSH para la identificación, el valor diagnóstico y la cuantificación de los esquistocitos. Int J Lab Hematol, 2012. 34(2): págs. 107-116.
  17. Gauer, R.L. y M.M. Braun, Trombocitopenia. Am Fam Physician, 2012. 85(6): págs. 612-622.
  18. George, J.N. y C.M. Nester, Síndromes de microangiopatía trombótica. N Engl J Med, 2014. 371(7): págs. 654-666.
  19. Scully, M., et al., Consenso sobre la estandarización de la terminología en la púrpura trombocitopénica trombótica y las microangiopatías trombóticas relacionadas. J Thromb Haemost, 2017. 15(2): págs. 312-322.
  20. Rauch, A., et al., Sobre la versatilidad del factor von Willebrand. Mediterr J Hematol Infect Dis, 2013. 5(1): pág. e2013046.
  21. Stockschlaeder, M., R. Schneppenheim y U. Budde, Actualización sobre los multímeros del factor von Willebrand: enfoque en los multímeros de alto peso molecular y su papel en la hemostasia. Blood Coagul Fibrinolysis, 2014. 25(3): págs. 206-216.
Material relacionado

¿Necesitas más información?

Para solicitar información médica de Takeda, contáctese a: medinfolatam@takeda.com

Para informar de un posible efecto secundario o informar de un posible defecto del producto, póngase en contacto con: AE.BRASAM@takeda.com

Información médica de contacto